流式细胞仪
流式细胞术简介
流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。
细胞前处理（以流式周期实验为例）
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收集细胞：弃去上清，加入1 ml PBS清洗一次，弃上清，再加入1 ml 0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。细胞悬液转入离心管中，1500 rpm离心5 min收集细胞。
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PBS洗涤细胞：加入3 ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1500 rpm离心5 min，弃上清。沉淀震荡混匀。
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固定过夜：沉淀中缓慢加入-20℃预冷的75％乙醇，重悬细胞，4℃过夜。
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PBS洗涤细胞：加入2 ml PBS混匀后，1500 rpm离心5 min收集细胞，PBS重悬，离心收集细胞。加入100 ul PBS重悬细胞。
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去除RNA：加入2 μl 浓度为1 mg/ml 的RNaseA（去离子水配制），37℃水浴40 min。
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荧光标记：加入100 µl浓度为100 µg/ml 的PI染色液（PBS配制），避光染色20 min。
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上机检测：流式细胞仪使用激发波长488 nm，发射波长585±21 nm进行检测，用flowj软件分析细胞周期以确定细胞周期分布。
图1 图2
图1是细胞凋亡测试，图2是细胞周期测试。
稳定细胞株构建
1.稳定细胞株构建介绍
构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，常用G418来代替新霉素进行选择性筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白，或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
2.技术路线图
【实验方法及流程】
1、目的细胞的合适抗生素浓度筛选；
2、目的细胞的合适病毒滴度筛选；
3、慢病毒构建与包装与滴度测定；
4、慢病毒感染；
5、特定抗生素筛选稳转细胞株；
6、稳转细胞株鉴定。